膠體金法檢測(cè)平臺(tái)
什么是膠體金？
膠體金（colloidal gold）是氯金酸（HAuCl4）在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，金離子還原后聚合成的一定大小的金顆粒，它由一個(gè)基礎(chǔ)的晶核（11個(gè)金原子形成的二十面體）和包圍在外的雙離子層構(gòu)成（內(nèi)層為負(fù)離子層AuCl2-,外層是帶正電荷的H+）。由于靜電作用，金顆粒之間相互排斥而懸浮成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液，故稱膠體金。膠體金具有高電子密度，能與多種生物大分子結(jié)合，已成為繼熒光素、放射性同位素和酶之后，在免疫標(biāo)記技術(shù)中較常用的一種非放射性示蹤劑。膠體金的粒徑一般在1-100nm之間，能夠均勻、穩(wěn)定地分散在液體中，呈球形小顆?；驒E圓形大顆粒。膠體金顆粒最外層可以吸附大量的正離子，能夠均勻分散在溶液中。
由于膠體金表面呈負(fù)電性，能夠與表面帶正電荷的抗原、抗體通過(guò)靜電作用進(jìn)行標(biāo)記。
膠體金法檢測(cè)原理
將特異性的抗體以條帶狀固定在膜上（T線），膠體金標(biāo)記試劑吸附在結(jié)合上（金墊），當(dāng)待檢抗原加到試紙條一端的樣本墊上后，樣本通過(guò)毛細(xì)作用向前移動(dòng)，溶解結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記試劑后相互反應(yīng)，再移動(dòng)至固定的抗原或抗體的區(qū)域時(shí)，待檢物與金標(biāo)試劑的結(jié)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留，聚集在檢測(cè)帶上，可通過(guò)肉眼觀察到顯色結(jié)果。
膠體金技術(shù)優(yōu)勢(shì)與不足
優(yōu)勢(shì)
快速：所有反應(yīng)能在15分鐘內(nèi)完成；
操作簡(jiǎn)便：便于個(gè)人自測(cè)或醫(yī)院檢測(cè)；
成本低：不需要特殊的儀器設(shè)備；
穩(wěn)定性好：試劑效期可達(dá)兩年或更長(zhǎng)時(shí)間；
缺點(diǎn)
較ELISA、化學(xué)發(fā)光等方法靈敏度低；
易出現(xiàn)假陽(yáng)性、假陰性；
存在HOOK效應(yīng)；
膠體金試劑條組成
膠體金試紙條主要由樣品墊、金墊、硝酸纖維素膜（NC膜）、吸水紙4個(gè)部分組成，從上至下依次首尾互相銜接，粘貼在PVC底板上。
作用
a. 樣品墊：檢測(cè)樣本滴加位置，對(duì)檢測(cè)樣本具有一定的過(guò)濾和緩沖作用，降低樣本中離子強(qiáng)度或酸堿度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾。
b. 金墊：將膠體金標(biāo)記抗體通過(guò)干燥固定在玻璃纖維素膜上，是追蹤抗體與抗原的反應(yīng)。
c. 硝酸纖維素膜：膜上預(yù)先包被上檢測(cè)線和質(zhì)控線，能夠與膠體金標(biāo)記物發(fā)生免疫反應(yīng)相結(jié)合，使膠體金在檢測(cè)線發(fā)生聚集，根據(jù)檢測(cè)線的顯色狀況進(jìn)行判讀結(jié)果。
d. 吸水墊：通過(guò)吸水作用使液體樣品向上流動(dòng)，帶動(dòng)金墊的金標(biāo)抗體向上移動(dòng)，從而與檢測(cè)線的抗原發(fā)生反應(yīng)。
膠體金試紙條的制作過(guò)程
膠體金的制備
在溶液中金顆粒呈圓形，邊緣平整，界限十分清楚。金顆粒表面帶有大量負(fù)電荷，由于靜電的排斥力，使其在水中保持穩(wěn)定狀態(tài)，形成膠體金。膠體金的制備方法有白磷還原法，抗壞血酸還原法，檸檬酸三鈉還原法和鞣酸-檸檬酸三鈉還原法。通過(guò)改變反應(yīng)體系中氯金酸與還原劑的比例可得到所需不同直徑的金顆粒。但前兩種方法制備得到的金顆粒直徑大小不均一，目前常用后兩種方法。
檸檬酸三鈉還原法膠體金的制備流程
以下流程供參考：
a. 取100ml超純水倒入250ml錐形瓶中
b. 滴加1.0%氯金酸溶液1.0ml，置于磁力攪拌器中連續(xù)攪拌并加熱至沸騰
c. 攪拌下快速加入1.0%檸檬酸三鈉溶液1.8ml，此時(shí)溶液逐漸由淺黃色變成灰黑色最后變成橙紅色
d. 待溶液變?yōu)槌燃t色后繼續(xù)加熱15min
e. 冷卻至室溫，0.1mol/ml K2CO3調(diào)節(jié)溶液pH至6.5左右
f. 超純水定容至100ml后，置于棕色瓶中4℃保存?zhèn)溆?/p>
此時(shí)制備好的膠體金溶液應(yīng)為澄清透亮，顏色均一，無(wú)異物，無(wú)漂金現(xiàn)象。
注意事項(xiàng)：
1）玻璃器皿的清洗
制金前，玻璃器皿先用王水或鉻酸溶液浸泡24h，用自來(lái)水沖洗干凈，然后依次用清潔劑洗滌3次，自來(lái)水沖洗3次，蒸餾水沖洗3次，雙蒸水沖洗3次。
2）試劑的配制
必須使用雙蒸水。氯金酸溶液可以放在4℃保存1年左右，還原劑檸檬酸三鈉需要現(xiàn)配使用。
抗原/抗體診斷原料的膠體金標(biāo)記
膠體金標(biāo)記原理
在堿性條件下，膠體金顆粒表面帶負(fù)電荷，可與抗原/抗體所帶正電荷基團(tuán)之間產(chǎn)生靜電吸引而牢固結(jié)合，這種結(jié)合對(duì)所標(biāo)記抗原/抗體的生物學(xué)活性無(wú)明顯影響。環(huán)境pH和離子強(qiáng)度是影響膠體金與抗原/抗體吸附的主要原因，膠體金顆粒的大小、蛋白質(zhì)的分子量及濃度等也影響蛋白質(zhì)的吸附。
膠體金標(biāo)記流程
注意事項(xiàng)
a. 膠體金最適pH的調(diào)整
用K2CO3或HCL溶液。原則上可選擇待標(biāo)記抗原/抗體等電點(diǎn)，也可以略偏堿。但各標(biāo)記物的最適反應(yīng)pH往往需要多次試驗(yàn)才能確定。
b. 抗原/抗體最適標(biāo)記量的確定
將待標(biāo)記抗原/抗體作一系列稀釋后，加入裝有膠體金的試管中，然后分別加入NaCl溶液，混勻靜置數(shù)小時(shí)，對(duì)照管與加入蛋白量不足的管顏色會(huì)由紅變藍(lán)，而蛋白量足或超過(guò)的管保持紅色不變，其中含蛋白量最低的一管即為穩(wěn)定膠體金所必須的最適標(biāo)記量。
c. 標(biāo)記過(guò)程
在電磁攪拌器下降1/10體積的合適濃度的抗原/抗體溶液加于膠體金溶液，反應(yīng)一定時(shí)間后加入BSA并調(diào)整至pH8.0，放置至室溫繼續(xù)反應(yīng)數(shù)分鐘，封閉多余的游離膠體金，穩(wěn)定膠體金標(biāo)記物。
d. 離心去除未結(jié)合的抗原/抗體，各粒徑的金粒子所需的離心轉(zhuǎn)速與時(shí)間均不一樣。
e. 離心后去上清，將沉淀用含PEG或BSA的緩沖液懸浮，恢復(fù)至原體積后再離心。
金標(biāo)墊的制備
將標(biāo)記好的金標(biāo)復(fù)合物噴涂在玻璃纖維素上，在干燥間或烘箱中37℃將其烘干。
樣品墊制備
將樣品墊處理液浸涂在玻璃纖維素膜上，在干燥間或烘箱中37℃將其烘干。
印模制備
將硝酸纖維素膜（NC膜）貼在PVC底板上，將印模機(jī)的C、T線調(diào)整搭配合適的距離，然后進(jìn)行印模，最后將印好的膜放在干燥間或烘箱中37℃將其烘干。
組板
將吸水墊和制備好的金墊、樣品墊裁切至合適的寬度，與印好C、T線的硝酸纖維素膜貼在PVC板的位置。
切條
根據(jù)檢測(cè)卡卡槽的寬度，將組裝好的大板裁切成一定寬度的檢測(cè)條，裁切寬度均一，無(wú)壓痕，無(wú)劃傷。
包裝
將裁切好的檢測(cè)條壓入檢測(cè)卡殼內(nèi)。
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